郭順星

中國醫學科學院藥用植物研究所

摘 要：藥用植物內生真菌普遍存在于健康植物組織和器官中, 種類繁多, 分布廣泛。到目前為止, 人們已從大量藥用植物中分離出不同類型的內生真菌, 這些植物廣泛分布于除南極洲以外的各種陸地生態系統中。隨著現代科學技術的迅速發展, 藥用植物內生真菌的研究也取得了長足的進步。由于內生真菌對于藥用植物的重要性, 其相關研究也受到了世界各國學者的高度關注。本文總結現階段藥用植物內生真菌相關研究, 并對未來研究的發展趨勢做出展望。

關鍵詞：藥用植物; 內生真菌; 菌根真菌;

The recent progress and prospects of research on endophytic fungi in medicinal plants

GUO Shun-Xing

Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences;

Abstract：Endophytic fungi are ubiquitous in the health tissues and organs of medicinal plants, with a great number of species and a wide range of distribution.To date, a large number of species have been isolated from diverse medicinal plants distributed in various ecological environments in the world, except Antarctica.With the rapid development of modern science and technology, the research on endophytic fungi in medicinal plants has achieved remarkable progress.In this paper, research progress on endophytic fungi in medicinal plant is summarized, and the future development trend in this field is expected and predicted.

Keyword：medicinal plants; endophytic fungi; mycorrhizal fungi;

　　藥用植物內生真菌的研究, 涉及植物學、微生物學、農學、化學、藥學、分子生物學、生物信息學等學科。它與一般植物內生真菌研究的不同之處在于:它不僅研究內生真菌的多樣性, 而且重點研究內生真菌對藥用植物生長發育的作用, 對藥用部位活性物質形成、含量變化和臨床藥效的影響, 以及與藥材道地性的關系。該領域的研究, 尤其重要的是可根據藥用植物與真菌密切關系的特性, 利用現代技術手段, 研究某些瀕危緊缺藥用植物資源保護和可持續利用的關鍵問題。

　　藥用植物內生真菌研究的目的和意義, 是根據內生真菌與藥用植物互作及其協同進化的生物學特性, 研究解決珍稀瀕危藥用植物資源保護和可持續利用的關鍵問題。利用幾乎所有植物都有內生真菌這一自然特點, 開展內生真菌在藥用植物生長發育和活性成分形成中的應用研究, 既不改變其遺傳背景, 又能達到藥材“道地性”的要求。從內生真菌生物學理論出發, 以應用基礎研究為主, 為我國藥用植物資源保護和可持續利用提供可靠的理論依據及強有力的技術支撐。所以, 藥用植物內生真菌生物學研究對闡明藥用植物分布、藥用植物生長發育特性、藥材道地性、藥效物質形成和積累、藥用植物資源再生具有重要意義。

1 藥用植物與內生真菌

　　藥用植物, 是指醫學領域中用于預防和治療疾病的一類植物, 藥用植株的全部或一部分供臨床使用或作為制藥工業的原料。廣義而言, 還可以包括用作營養劑、保健食品、農藥和獸醫用藥的植物資源。

　　內生真菌是指生活在植物細胞中或在其生活史某一時期生活在植物組織內, 對植物組織沒有引起明顯病害的一類真菌。廣義而言, 還包括那些在生活史中的某一階段營表面生的腐生菌, 對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原真菌和菌根真菌 (Smith&Read 2008) 。

　　人類對內生真菌的研究始于19世紀末, 對于植物內生真菌的研究已有100多年的歷史, 早在1898年人們就從黑麥草Lolium temulentum L.中分離得到了首株內生真菌 (Lin et al.2007) 。此后的幾十年內, 植物內生真菌的研究范圍僅限于一些重要的經濟植物中。直到1993年, 美國科學家從藥用植物太平洋短葉紅豆杉Taxus brevifolia韌皮部中分離到1株能產紫杉醇的內生真菌Taxomyces andreanae Strobel et al. (Stierle et al.1993) , 人們才真正意識到內生真菌是人類尋找新型藥用活性成分的重要潛在原料, 尤其是藥用植物中內生真菌的相關研究, 已經成為全世界科學家研究的熱點之一。隨后植物內生真菌的研究范圍也慢慢擴展到藻類、地衣、蕨類等低等植物。

　　幾乎所有的植物都存在內生真菌, 它們生活在植物體內的特殊環境中, 并與宿主植物長期協同進化, 在漫長的共進化過程中彼此構成了穩定的生態關系。目前, 對二者之間的關系一般分為兩種觀點。一種觀點將其描述為互惠互利的共生關系, 內生真菌可以從宿主植物中吸收營養物質供給自己生長發育的需要, 內生真菌也可以提高宿主植物對脅迫環境如病蟲害、干旱和水澇等的適應性和抗性, 并在宿主植物的生長發育和繁殖中起重要的作用。另一種觀點認為二者是特殊的寄生關系, 這種寄生一般不引起植物的相關病癥, 而當植物衰老或受到環境脅迫時又會變成病原菌而引起植物病害, 即內生真菌和宿主植物之間是一種處于動態平衡的拮抗關系 (Aly et al.2011) 。

　　內生真菌與藥用植物形成共生關系的過程涉及細胞形態發生、信號識別、轉導、營養物質交換和基因表達等一系列復雜的過程。內生真菌分布于藥用植物的根、莖、葉、花、果實和種子等各個部位, 二者形成共生關系的過程一般分為接觸、侵入和定殖等過程。在侵染早期, 雙方各自釋放信息素類似物并被彼此識別, 內生真菌可以菌絲或孢子形式通過變形、吸器或滲透等多種途徑對宿主植物進行侵染, 也可以通過分解植物表皮細胞壁或通過各種自然孔口 (包括側根發生處、氣孔、水孔等) 或傷口 (包括土壤對根的磨損、病蟲對植物的損害及收割植物造成的傷口等) 等傳播途徑進入植物。真菌侵染植物時, 植物會發生一系列的反應, 如植物本身的結構阻止真菌的侵入, 植物組織和細胞發生多種變化阻止真菌侵入等, 同時真菌分泌多種物質幫助自身進入植物體內, 這期間發生非常復雜的物理和化學反應, 經過侵染與反侵染后, 內生真菌在植物的表皮、皮層、葉肉細胞等處定殖, 很少或不侵入維管系統。在這些組織內, 內生真菌一般以菌絲的形態存在, 少數真菌可以形成厚垣孢子、微菌核、小囊泡等結構。

　　直到現在, 每年仍然從各種植物中分離、鑒定出大量的內生真菌, 然后再研究其功能及實際應用。總結近年來藥用植物內生真菌的研究內容, 大致體現在以下幾個方面。

1.1 藥用植物內生真菌的分離、鑒定及多樣性

　　藥用植物內生真菌普遍存在于健康植物組織和器官中, 種類繁多, 分布廣泛。到目前為止, 人們已從多種藥用植物中分離出不同類型的內生真菌, 這些植物廣泛分布于除南極洲以外的世界各地, 生態環境有很大差異, 從中分離到的內生真菌物種種類繁多, 涉及子囊菌、擔子菌、接合菌、無孢菌類等類群。雖然從植物體內能夠分離得到大量的內生真菌類群, 但是由于內生真菌與宿主間具有一定的專一性, 假設每種宿主體內包含有4、5種專性內生真菌, 以地球目前已知的25萬種植物數量計算, 內生真菌數量可大于100萬種 (林燕青和洪偉2012) 。

1.2 內生真菌對藥用植物生長、發育的影響

　　在過去的數十年里, 研究表明內生真菌影響著藥用植物生理進程的不同方面。如:從滇重樓根狀莖分離到8株能促進滇重樓胚發育的內生真菌;茅蒼術與其內生真菌共生培養后, 其組培苗葉片、根的鮮重和干重明顯增加;蘭科藥用植物的內生真菌能產生吲哚乙酸、赤霉素、脫落酸、玉米素等植物激素;苦皮藤根韌皮部分離的內生真菌對黏蟲、小菜蛾都具有較強的胃毒活性;苦楝中分離出的內生真菌對馬尾松毛蟲有抗蟲活性 (孫奎2010;丁常宏等2013;解修超等2013) 。以上研究可以看出:首先, 藥用植物內生真菌能夠產生植物生長所需的調節劑類物質, 以增強植株對微量元素的吸收, 進而促進植物的生長發育;其次, 藥用植物內生真菌能夠提高宿主植物的生理活性指標;再次, 藥用植物內生真菌能夠提高宿主植物抗逆性, 包括生物脅迫與非生物脅迫;最后, 藥用植物內生真菌是某些特殊植物的營養來源, 是保障其正常生長發育、生殖遺傳必不可少的重要條件。

1.3 內生真菌對藥用植物次生代謝產物、活性物質的調節

　　內生真菌通過影響和調節藥用植物次生代謝產物的合成、含量及累積, 直接或者間接地影響藥用植物活性物質的分布、含量。例如:絲核菌株R02和R04能促進金線蓮葉片超氧化物歧化酶、根系酸性和堿性磷酸酶活性以及抗壞血酸、多酚、類黃酮和多糖化合物含量;鐵皮石斛內生真菌能促進鐵皮石斛次生代謝產物的積累, 增加多糖含量;大戟內生真菌接種到大戟組培苗上, 發現內生真菌E4和E5均能促進大戟組培苗中兩種萜類物質異大戟素、大戟醇的合成;刺五加內生真菌可顯著影響刺五加中皂苷合成關鍵酶基因的表達量, 進而影響刺五加的皂苷含量 (曾培源和吳錦忠2010;何新華等2012;丁常宏等2013) 。

1.4 藥用植物內生真菌的培養及替代藥用植物

　　目前許多藥用植物資源枯竭, 而多種高效的藥用活性成分難以人工合成, 或合成藥物難以發揮相同功效。普遍存在于藥用植物組織和器官中的內生真菌具有豐富的多樣性, 部分內生真菌在代謝過程中產生的活性物質在藥物研發、植物病害生物防治等方面表現出了巨大的經濟價值及應用前景, 因此受到世界各國科學家的廣泛關注。1993年人們首次從短葉紅豆杉中分離得到一株能合成抗癌物質紫杉醇的內生真菌, 這表明有的內生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力。較為成功的例子還有:裂褶菌屬Schizophyllum內生真菌能產生三尖杉酯堿類物質, 能抑制真核細胞內蛋白質的合成, 是一類潛在的抗癌藥物;銀杏的內生真菌裂褶菌Schizophyllum發酵液和菌絲體產黃酮類成分槲皮素;長春花分離得到的尖孢鐮刀菌可培養產生長春新堿等 (徐范范等2010;丁海娥等2013;周永強等2014) ?？傮w來講, 藥用植物內生真菌次生代謝產物與藥物開發的關注點主要在以下幾個方面:首先, 抗腫瘤活性物質, 如內生真菌培養物產紫杉醇和紫杉烷類、長春新堿、鬼臼毒素、喜樹堿等;其次, 抗菌活性物質, 如縮酚酸環醚、萘醌類等;再次, 抗氧化活性物質, 如黃酮及類黃酮、酚類、多糖等;最后, 抗炎活性物質, 如香豆素類等。

2 藥用植物內生真菌研究現狀

　　近7年來 (2010–2017年) , 國內外發表了許多與藥用植物內生真菌相關的研究論文、綜述、會議報告。通過Web of Science統計得出核心庫期刊發表的近5年與藥用植物內生真菌 (medicinal plant and endophytic fungi) 相關論文共計272篇, 其中2010年 (26篇) 、2011年 (29篇) 、2012年 (61篇) 、2013年 (32篇) 、2014年 (27篇) 、2015年 (30篇) 、2016年 (34篇) 、2017年 (33篇) 。研究較為熱門的國家包括中國、印度、巴西、泰國、美國、德國、日本、韓國、墨西哥和馬拉西亞等。

2.1 各國藥用植物內生真菌研究概況

　　近年來, 中國藥用植物內生真菌的研究開展較為廣泛, 包括鐵皮石斛、天麻、金線蓮、降香、滇重樓、盾葉薯蕷、沉香、銀杏、無花果、多花黃精等, 主要研究了內生真菌對藥用植物生長發育、種子萌發、有效成分累積等方面的作用, 以及從藥用植物內生真菌中篩選分離出具有抗菌、抗炎和抗腫瘤的天然活性物質。中國醫學科學院藥用植物研究所郭順星課題組以鐵皮石斛、天麻、金線蓮以及樹脂類藥材沉香和降香、藥用真菌豬苓等為研究對象, 主要研究內生真菌對藥用植物生長發育、種子萌發、藥效成分累積、活性物質變化等方面的功能, 并應用于實際栽培、生產及產品開發 (Chen et al.2011;Chen et al.2013;Sun et al.2015) 。中國農業大學周立剛課題組從多種藥用植物及其內生真菌和病原真菌中尋找新型具生物活性的次生代謝產物, 從次生代謝的角度探討植物與內生真菌之間的相互作用和協同進化關系, 并利用現代生物技術手段, 有效提高活性成分的產量, 為其應用提供依據 (Li et al.2014;Shan et al.2014;Tian et al.2017) 。浙江大學章初龍課題組開展了藥用植物沉香、銀杏、無花果、多花黃精等內生真菌的基礎研究和應用開發, 該課題組從藥用植物內生真菌中篩選分離出幾十種具有抗菌活性物質的天然產物, 并將其應用到生物農藥的研究開發, 如木霉菌素、產氣霉菌等 (Wang et al.2011) 。西北農林科技大學唐明課題組進行了林木菌根真菌種質資源、生態分布和生物多樣性的研究, 并利用菌根真菌提高枸杞、刺槐、垂柳等植物的抗逆性, 詳細分析了菌根真菌提高植物耐旱、耐病蟲害的分子遺傳特性 (Zhang et al.2012) 。廈門大學沈月毛課題組利用藥用植物內生真菌發現了多種抗腫瘤和抗菌新化合物 (Wang et al.2010) 。此外, 我國科學家最新的研究還包括從人參中分離得到兩株新的內生真菌Fusarium sp.PN8和Aspergillus sp.PN17, 具有抗菌活性, 并且可用于發酵制備人參皂苷等成分 (Jin et al.2017) ;研究分析了內生真菌Gilmaniella sp.AL12通過影響乙烯信號通路, 介導蒼術倍半萜的生物合成等 (Yuan et al.2016) 。由此看出, 我國科學家在藥用植物內生真菌的研究中, 取得了豐碩的成果。

　　印度科學家對藥用植物內生真菌的研究也處于熱點狀態, 印度同為四大文明古國, 其傳統醫藥學包括阿育吠陀、尤納尼、西達等, 有著豐富的傳統藥用植物資源, 同樣也擁有豐富的內生真菌資源。近年來, 印度巴納拉斯大學 (Banaras Hindu University) 的Kharwar課題組發表多篇論文 (Kharwar et al.2010;Kharwar et al.2011;Gond et al.2012;Kharwar et al.2012) , 他們從印度傳統藥夜花屬夜茉莉Nyctanthes arbor‐tristis中分離得到19種內生真菌, 研究了其多樣性和抗菌活性;該課題組還從檸檬桉Eucalyptus citriodora的葉片中得到了內生真菌與外生真菌, 并比較了二者的抗菌活性。此外, 印度科學家最新的研究還包括:從印度藥用植物黃花稔Sida acuta中分離得到具有抗菌活性的硫色曲霉Aspergillus sulphureus, 可抗金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌 (Murali et al.2017) ;發現光果甘草的內生真菌腐皮鐮刀菌Fusarium solani具有抗結核的作用 (Shah et al.2017) ;從印度芳香植物檸檬馬薄荷Monarda citriodora分離得到28株內生真菌, 分別來自11個屬, 包括鐮刀菌、黃曲霉、Muscodor等, 具有開發植物生物防治物質的潛力 (Katoch&Pull 2017) ;并發現姜黃Curcuma longa的內生真菌莖點霉菌Phoma herbarum具有拮抗斑葉病的活性等 (Gupta et al.2016) 。

　　巴西地處南美洲東部, 由亞馬遜河孕育出豐富的植被資源, 共有植物4萬多種, 許多植物用于醫療保健、防治疾病。多樣的氣候、地理條件使得其內生真菌資源十分豐富。巴西米納斯聯邦大學 (Federal University of Minas Gerais) Rosa Luiz和Rosa Carlos等科學家所在課題組近年來發表了多篇從巴西傳統藥用植物中得到的內生真菌相關論文 (Rosa et al.2012;Vieira et al.2012;Rosa et al.2013;Vieira et al.2014) 。他們從茄科植物Solanum cernuum中分離出246種各類內生真菌、豆科植物Stryphnodendron adstringens中鑒定出25屬320種內生真菌, 并發現多種藥用植物內生真菌具有強烈抗菌活性, 他們還詳細研究了菊科藥用植物Smallanthus sonchifolius中內生真菌Coniochaeta ligniaria (Grev.) Massee的抗菌活性。此外, 巴西科學家最新的研究還包括, 發現間座殼菌Diaporthe sp.產物β‐ (1‐3, 1‐6) ‐d‐glucans具有抗惡性細胞增殖作用 (Orlandelli et al.2017) ;從野木藍Indigofera suffruticosa葉片中分離得到65株內生真菌, 其中18株具有抗細菌活性等 (Dos et al.2015) 。

　　泰國處于熱帶氣候, 雨林資源豐富, 藥用植物及內生真菌分布廣泛。宋卡王子大學 (Prince Songkla University) 的Phongpaichit課題組從3種藥用海草中分離鑒定出160種潛在的內生真菌, 并研究了它們的抗菌活性 (Supaphon et al.2013) 。清邁大學 (Chiang Mai University) 的Lumyong課題組從樟科鈍葉桂Cinnamomum bejolghota分離出2 774株內生真菌, 此外他們還從分子形態特征鑒定出Muscodor屬4種新的內生真菌 (Suwannarach et al.2012;Suwannarach et al.2013) 。此外, 泰國科學家最新的研究還包括, 從傳統藥用植物Melodorum fruticosum的花中分離得到52株內生真菌, 其中間座殼菌Diaporthe spp.具有抗菌和抗氧化的作用 (Tanapichatsakul et al.2017) ;在沉香Aquilaria subintegra樹脂部位發現內生真菌33株, 并從其中4株的發酵產物中, 得到沉香樹脂類似的化合物, 且具有抗氧化活性 (Monggoot et al.2017) 。

　　美國擁有廣袤的平原和山區資源, 藥用植物和內生真菌的研究也處于先進水平, 不僅研究本國資源, 還跨區域與墨西哥、印度、巴西等國合作開展了更為廣泛的研究。近年來, 美國本土藥用植物內生真菌研究以馬里蘭大學 (Maryland University) Gazis課題組為代表, 他們從橡膠樹Hevea brasiliensis葉和莖中共分離出175株內生真菌, 采用了ITS和LSU序列片段對其進行了分類鑒定, 其中97%屬于子囊菌, 而擔子菌僅占1%;而又以Penicillium、Pestalotiopsis和Trichoderma這3屬最多;在葉片中比莖中分離得到更多的內生真菌。以上結果顯示, 橡膠樹內生真菌具有多樣性, 不同部位具有不同類型的內生真菌 (Gazis&Chaverri2010) 。此外, 美國科學家最新的研究還包括, 從西棲蓼的Persicaria amphibia內生真菌Montagnulaceae sp.DM0194得到Azaphilones類化合物Montagnuphilones A‐G, 具有細胞毒性 (Luo et al.2017) ;從內生真菌踝節菌屬Talaromyces minioluteus分離得到Meroterpenoids化合物Talarolutins A‐D, 具有對前列腺癌的細胞毒性 (Kaur et al.2016) ;從龍血樹Dracaena draco內生真菌可可球二孢菌Botryodiplodia theobromae Pat.分離得到抗細菌活性物質等 (Zaher et al.2015) 。

　　德國科學家對藥用植物內生真菌的研究具有較高水平, 杜塞爾多夫大學 (Dusseldorf University) 的Proksch Peter課題組對高等植物內生真菌的化學成分進行了全面的綜述, 詳盡地闡述了內生真菌是提供新的天然藥用化合物的寶庫 (Aly et al.2010) , 該文詳細描述了在內生真菌研究中取得重大成就的紫杉醇、喜樹堿和鬼臼毒素等化合物, 以及各種活性物質的抗菌、抗寄生蟲和細胞毒素作用等, 并分析了利用藥用植物內生真菌生產藥物的影響因素。德國天然產物研究所 (HKI) 的Hertweck Christian課題組研究了藥用植物鬼針草Bidens pilosa內生真菌Botryosphaeria rhodina Berk.&M.A.Curtis的化學成分Botryorhodines A‐D, 描述了其抗真菌活性和細胞毒性 (Abdou et al.2010) 。多特蒙德大學 (TU Dortmund University) Kayser Oliver課題組從大麻中分離出了30種內生真菌, 并研究了它們的多樣性和作為介質在植物真菌體系中發揮的作用 (Kusari et al.2013) 。此外, 德國科學家還在光黑殼屬內生真菌Preussia similis發現二環聚酮化合物Preussilides A‐F具備的抗惡性細胞增殖作用等 (Noumeur et al.2017) 。

　　日本對于藥用植物內生真菌的研究開展的時間較早, 也較為深入, 并且擅長國際合作。東京大學Abe課題組從曼陀羅Datura stramonium中得到的內生真菌可以產生真菌毒素物質 (Sun et al.2012) ;大阪大學的Nihira課題組從內生真菌Bipolaris sp.中得到了化學物質Bipolamides, 深入分析了其化學結構和藥理活性 (Siriwach et al.2014) ;山口大學Ito課題組和埃及科學家合作, 從埃及天仙子中分離得到多種抗真菌藥用活性的內生真菌 (Abdel‐Motaal et al.2010) ;山形大學Shiono課題組研究了藥用植物內生真菌鐮刀菌中聚酮化合物的代謝途徑 (Shiono et al.2013) 。此外, 日本科學家還從藥用植物Coccinia grandis葉片中分離得到內生真菌稻黑孢霉Nigrospora oryzae (B.&Br.) Petch, 具有很強的抗病原真菌活性 (Thanabalasingam et al.2015) 。

  　　韓國也對本國的藥用植物內生真菌進行了一定的研究。建國大學的Kumaran課題組從Morinda citrifolia中分離出可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae, 并研究發現它能分泌紫杉酚, 具有很強的抗癌活性 (Pandi et al.2011) 。漢城國立大學Diederich課題組研究了內生真菌Stemphylium globuliferum (Vestergr.) E.G.的代謝產物altersolanol A, 發現這類物質具有很強的抗癌活性, 并對其抗癌機制進行了深入研究 (Teiten et al.2013) 。此外, 韓國忠南大學Yu課題組從韓國栽培的枸杞中得到了10種內生真菌 (Paul et al.2014) 。

　　墨西哥科學家近年來也分離得到多種藥用植物內生真菌, 并研究了它們的化學成分。研究機構Cinvestav IPN的Rivera‐Orduna課題組從墨西哥紅豆杉Taxus globosa中一共分離鑒定了116種內生真菌 (Rivera‐Orduna et al.2011) 。墨西哥國立自治大學 (Univ Nacl Autonoma Mexico) 的Mata課題組研究了來自內生真菌的化合物Thielavins A, 發現其具有α‐葡糖苷酶抑制劑作用 (Rivera‐Chavez et al.2013) 。

　　馬來西亞與泰國氣候環境相似, 同樣擁有多樣的藥用植物資源和內生真菌資源。馬來西亞布特拉大學 (University Putra Malaysia) 的Cheah課題組采用分子特征結合形態特征的方法, 從2種藤黃屬Garcinia植物鑒定了24種內生真菌 (Sim et al.2010) 。馬來西亞理科大學 (University Sains Malaysia) 的Tong課題組從Orthosiphon stamineus中分離了72種內生真菌, 并研究了其中的抗菌活性 (Tong et al.2011) 。Teknol大學的Ramasamy則綜述了馬來西亞藥用植物內生真菌的化學成分, 尤其是其具有的抗菌活性和細胞毒性 (Ramasamy et al.2010) 。

此外, 我國臺灣食品工業發展研究所Cheng課題組研究發現植物內生真菌Biscogniauxia formosana、Annulohypoxylon squamulosum和Annulohypoxylon ilanense的次生代謝產物具有抗細菌、抗真菌和細胞毒活性 (Cheng et al.2012a, 2012b;Wu et al.2013) 。澳大利亞國立大學 (Australian Natl Univ) 研究了內生真菌代謝產物Pestalotiopsones D‐E, 描述了其化學構型和潛在活性 (Beekman&Barrow 2013) 。瑞典Umea大學科學家從山楊樹Populus tremula葉片中分離了1 000多種內在真菌, 鑒定為100多種形態群, 采用18S和ITS序列片段對內生真菌進行了分子鑒定, 多數內生真菌屬于擔子菌和子囊菌, 如Sordariomycetes和Dothideomycetes。該文詳細分析了楊樹葉片內生真菌的種群特征和多樣性, 鑒定出多種病原菌和抗病活性的內生真菌, 為以后的應用開發提供了有力的數據支持 (Albrectsen et al.2010) 。

2.2 國際合作

　　國際合作在藥用植物內生真菌的研究也有了廣泛開展, 其中美國、日本等發達國家常常與巴西、泰國、印度等資源豐富的國家展開合作。近年來最為代表性的一篇文章便是由匈牙利、德國、中國、埃及四國科學家共同參與的一項研究, 該研究以紅樹Laguncularia racemosa.內生真菌Corynespora cassiicola (Berk.&M.A.Curtis) C.T.Wei為基礎, 深入研究了其癸內酯衍生物的化學結構和生物活性, 他們發現兩種異構體能對人體的多種酶, 如IGF1‐R和VEGF‐R2, 產生強烈的抑制作用 (Ebrahim et al.2012) 。

　　泰國皇太后大學、中國科學院和沙特阿拉伯國王大學三國合作完成的綜述, 從形態、系統進化、生物化學和多樣性等多方面分析了藥用植物內生真菌Pestalotiopsis sp.的各個特征。文章綜述了該屬真菌在鑒定難點、分類學上的分歧, 采用菌絲形態、ITS序列特征、化學特征等多種方式來研究Pestalotiopsis、Pestalotia及相關內生真菌的異同, 描述了它們在醫藥開發中的潛力 (Maharachchikumbura et al.2011) 。

中英科學家合作, 總結了內生真菌與藥用植物之間的“友好”關系, 并進行了綜述。該文總結以往研究發現, 內生真菌對于藥用植物而言, 是一種中藥的微生態環境, 經過長期的協同進化, 內生真菌可影響藥用植物的生物合成、次生代謝、藥材產量和品質、宿主植物生長發育、抗逆性、抗病性等諸多方面。本文對過去30年的研究進行歸納, 被廣泛引用。此外, 他們還總結了1990–2013年具有抗癌活性的內生真菌研究, 并歸納了抗癌活性物質 (Chen et al.2016;Jia et al.2016) 。

3 藥用植物內生真菌研究展望

　　近30年來, 已經從數百種藥用植物中分離鑒定出大量的內生真菌, 檢測并純化出較多的活性物質, 取得了豐碩的成果, 但很多問題仍然存在:表面消毒不徹底導致外源真菌混入內生真菌中, 形成錯誤的研究結果, 然而嚴格的表面消毒過程往往誤殺了很多內生真菌;在藥用植物內生真菌分離過程中即使采用多種培養基也不能保證全部的內生真菌都被分離出來, 如一些生長較慢的真菌、不能在人工培養基上生長的真菌等;藥用植物內生真菌的次生代謝產物含量往往較低, 加之分離純化及頻繁傳代導致其代謝產物的特性和含量不穩定, 給后續的檢測和分離工作增加了難度;內生真菌與宿主的相互關系的機理尚不明確, 分子機制的研究成果更加稀少, 造成知其然不知其所以然的現狀;目前對藥用植物內生真菌的研究主要集中在實驗階段, 其實際應用的效果還亟待研究和實踐。

　　如今, 大量現代化科技手段已被引入到藥用植物內生真菌的研究領域, 如印度科學家已完成內生真菌Diaporthe ampelina (Phomopsis sp.) 的全基因組測序 (Savitha et al.2016) ;蘭科植物天麻、金線蓮、鐵皮石斛與內生真菌相互作用的轉錄組研究 (Liu et al.2015;Chen et al.2017;Zeng et al.2017) ;Terminalia laxiflora Engl&Diels內生真菌Curvularia sp.的代謝組分析等 (Tawfike et al.2017) 。可以展望, 未來更多新技術的應用, 將提升藥用植物內生真菌研究的整體水平。

　　從本期發表的論文來看, 在內生真菌多樣性方面涉及到的藥用植物包括新疆天山雪蓮、紅景天、手參、馬比木等, 所采用的研究方法包括傳統的分離鑒定以及基于Illumina Mi Seq平臺的高通量測序技術 (陳娟等2018;陳艷紅等2018;Liu et al.2018;譙利軍等2018) 。此外, 針對特定類群的內生真菌也開展了DNA提取方法的優化及結合ITS序列及ITS2二級結構實現準確鑒定 (鐘志敏等2018) , 該方法可對今后開展其他特定類群的內生真菌鑒定提供理論借鑒。在內生真菌次生代謝產物研究方面涉及到藥用植物包括沙漠藥用植物 (Li et al.2018) 、南方紅豆杉 (陳淑娟等2018) 、蛇足石杉 (鄭瑞等2018) 以及七葉樹 (劉軍生等2018) 等, 宿主植物生境來源呈現多元化, 所分離到的次生代謝物均具有較好的生理活性, 如抑制腫瘤細胞增殖、抑制特定酶活性、抑菌作用等, 有些還具有潛在的生態功能, 如沙漠藥用植物的內生真菌中分離到的酚類化合物可抑制其他植物根的生長, 暗示其在宿主植物的生態適應性方面可能起到重要作用 (Li et al.2018) 。在藥用植物與內生真菌互作方面既有內生真菌對宿主植物表現出的促生作用 (周麗思等2018) 、對宿主植物種子萌發的促進作用 (楊建文等2018) , 也有從蛋白組學及基因組學水平開展的互作機制的研究 (曾旭等2018a, 2018b) 。整體較好地反映出我國在藥用植物內生真菌方面研究的良好發展態勢。

　　以上分析表明, 內生真菌在藥用植物領域的廣泛應用, 將有可能成為實現藥材優質、高效、安全、穩定、質量可控的有效新技術。但目前, 我國內生真菌在藥用植物領域的應用仍處于起步階段, 研究過的內生真菌數量僅為其巨大資源庫的很少一部分, 且多限于內生真菌對藥用植物生長發育、有效成分、抗逆性等表觀研究, 對其具體作用機制仍不明確。利用現代技術手段, 對內生真菌進行進一步的系統研究亟待開展。可以預見, 充分利用內生真菌的研究成果將可為藥用植物現代化發展開辟新途徑, 并成為推動我國中藥材產業化、規?；H化發展的新動力。

參考文獻（略）

本文轉在自《菌物學報》2018年01期序言